Science：利用RNA-SPLIT技術揭示Xist?RNA的動態變化

2021年6月24日訊/生物谷BIOON/---哺乳動物中的X染色體失活（XCI）使得XX雌性相對于XY雄性的X連鎖基因表達水平相等。XCI過程由非編碼RNA Xist（X 染色體失活特異性轉錄物）控制，它在需要失活的X染色體中表達，在那里順式積累并招募基于染色質的基因沉默所需的因子。順式限制在單個染色體區域的分子基礎尚不清楚，但人們認為這涉及特定的Xist RNA結合蛋白（例如CIZ1和SPEN）與核蛋白支架之間的相互作用。

為了更好地了解Xist RNA的獨特和不尋常的行為，來自英國牛津大學的研究人員在一項新的研究中，開發出RNA-SPLIT（sequential pulse localization imaging over time, 時間序列脈沖定位成像）：一種在經歷XCI的細胞中對單個Xist分子進行時間分辨成像的方法。他們利用BglG/Bgl莖環系統來標記特定的RNA和一種BglG-HaloTag融合蛋白。在活細胞（用多西環素誘導的Xist RNA進行改造的小鼠XX胚胎干細胞）中用不同的熒光HaloTag配體連續脈沖，使得他們能夠使用超分辨率三維結構照明顯微鏡（3D-SIM）對單一Xist RNA分子進行時間分辨率成像。相關研究結果近期發表在Science期刊上，論文標題為“Time-resolved structured illumination microscopy reveals key principles of Xist RNA spreading”。

與以前的工作一致，這些作者觀察到每個細胞中由大約50到100個Xist分子組成的區域（下稱Xist區域）。他們確定了誘導后1.5至5小時的時間窗口，在此期間，他們可以定量確定Xist分子在Xist區域內的逐漸增加，被稱為擴展階段（expansion phase）。一個較晚的時間點（誘導后24小時）被作為穩態下Xist RNA行為的代表。RNA-SPLIT的應用使他們能夠測量這兩種階段中Xist RNA動態的關鍵參數。在擴張期和穩定期，Xist分子分別大約每2或4小時周轉一次。通過多西環素沖刷抑制Xist轉錄，導致Xist RNA穩定性明顯增加，這表明存在一種反饋機制來平衡轉錄和周轉率。他們觀察到在擴展階段Xist RNA區域的徑向逐漸擴大，估計速度為每小時8立方微米。徑向擴大在穩定狀態下并不明顯，這表明一旦建立了X染色體失活，Xist RNA分子就會以一種更隨機的方式定位。RNA-SPLIT進一步顯示，新合成的Xist分子主要定位于存在事先合成的Xist分子的位點---他們稱之為耦合（coupling）。

這些作者擴展了他們的分析，以探究剔除CIZ1和SPEN的影響，這兩個因子與Xist RNA的定位和順式限制有關系。CIZ1的功能喪失導致Xist RNA在分化的細胞中廣泛地散布于細胞核，這會增加Xist RNA的轉錄水平和穩定性。盡管Xist RNA廣泛散布于細胞核，但之前合成和新合成的Xist分子的耦合仍然保留。SPEN的功能喪失導致了Xist RNA長距離定位存在重大缺陷，降低了Xist RNA的穩定性，并破壞了Xist RNA的耦合。SPEN在Xist RNA行為中的功能與它在XCI中基于染色質的基因沉默中的功能在遺傳上是可分離的。

綜上所述，RNA-SPLIT的開發使得XCI建立過程中單個Xist分子的空間定量分析成為可能。這種方法的應用揭示了Xist RNA行為（包括對Xist周轉和轉錄的反饋控制、Xist RNA擴散的動力學以及之前合成和新合成的Xist分子的耦合）的基本原則。除了這些見解之外，RNA-SPLIT還促進了人們對CIZ1和SPEN因子如何影響Xist RNA行為和定位的不同方面的理解。（生物谷 Bioon.com）