Genome?Biology：開發出單細胞基因組單分子測序新方法

單細胞全基因組測序技術（scWGS）可以有效揭示生物樣品中不同細胞之間的異質性，并系統鑒定單個細胞的基因組中發生的遺傳變化，例如拷貝數變異（CNV）和點突變（單核苷酸變異，SNV）等。過去十年，研究人員已經開發出多種單細胞基因組擴增技術，例如簡并寡核苷酸引物PCR擴增技術(DOP-PCR)、多重置換擴增技術（MDA）、多重退火和基于環的擴增循環技術（MALBAC），以及通過轉座子插入和體外轉錄進行線性擴增技術（LIANTI）等。但是，目前的單細胞全基因組測序技術均基于二代測序（NGS）平臺，該平臺檢測準確度高，但是測序讀長相對較短（通常只有150bpX2），主要適用于檢測單個細胞中的單核苷酸變異（SNV）、小的插入缺失（<50bp，Indel）以及拷貝數變異（CNV）等。由于二代測序平臺讀長的限制，對于基因組中結構變異的檢測具有很大的局限性。結構變異（包括插入、缺失、重復和易位等）是人類體細胞遺傳變異的主要來源之一，對腫瘤的發生、發展和轉移具有潛在的驅動作用，然而目前在單個細胞水平對基因組結構變異的研究卻鮮有報道。

針對基于二代測序平臺的單細胞基因組測序技術難以高效鑒定單個細胞中結構變異這一世界難題，北京未來基因診斷高精尖**中心、北京大學生物醫學前沿**中心湯富酬課題組在Genome Biology上在線發表了題為“SMOOTH-seq： single-cell genome sequencing of human cells on athird-generation sequencing platform”的研究論文，在國際上率先開發了基于三代測序（單分子測序）平臺的單細胞基因組測序技術。

該研究的主要突破有：

開發了一種高精度的基于三代測序（單分子測序）平臺的單細胞基因組測序方法——SMOOTH-seq（Single-MOlecule real-time sequencing of LOng Fragments amplified THrough Transposon insertion）。使用優化后的Tn5轉座反應，SMOOTH-seq能夠從單個細胞中擴增出平均長度約6kb的基因組片段（測序讀長比單細胞基因組二代測序技術長了20倍左右），通過引入與單分子測序平臺兼容的細胞條形碼使單細胞基因組DNA擴增子適用于Pacbio sequel II平臺的HiFi測序模式。測序后的數據中，產生的環化測序（circular consensus sequencing， CCS）的讀長平均在6kb左右， *長可達43kb。

該研究開發的SMOOTH-seq方法能夠在單個細胞中高效檢測基因組結構變異。在單個K562細胞中，當測序深度僅為0.4X時，基因組覆蓋度可達19%。該研究對91個單細胞進行SMOOTH-seq分析，從中檢測到4，790 個缺失事件和5，589個插入事件，其中87%的缺失片段和91% 的插入片段長度小于1kb，檢測到的插入事件DNA片段*長達到7.7kb。同時，該研究也在K562細胞中檢測到521個易位事件，包括準確檢測到兩對經典融合基因：BCR-ABL 和NUP214-XKR3。SMOOTH-seq技術對結構變異的檢測精度高，當使用K562大量細胞的基因組三代測序結果作為比較基準時，該研究中使用的K562細胞系的每個單細胞中的結構變異檢測平均**度為75％，特別是在單個細胞中檢測插入事件平均**度為85％。此外，SMOOTH-seq 也可以以1Mb 的分辨率準確檢測到兩個K562克隆之間的不同拷貝數變異（CNV）事件。

該研究開發的SMOOTH-seq方法能夠在單個細胞中高效檢測染色體外環形DNA（ecDNA）。已有的研究報道表明，染色體外環形DNA在腫瘤發生中比較常見，且致癌基因能夠在染色體外環形DNA中進行大量擴增，促進腫瘤發生和轉移。SMOOTH-seq技術產生的長讀長數據，使其能夠被用于在單個細胞中精準捕獲小于10kb的全長染色體外環形DNA。本研究同時開發了用于鑒定K562細胞系中的染色體外環形DNA的生物信息學分析方法。當僅有一個拷貝的Tn5轉座酶與一個染色體外環形DNA分子結合時，整個環形DNA分子就可被完整擴增為一個線性片段，即單個讀段即可覆蓋一個染色體外環形DNA分子的全長序列。通過統計Tn5插入位置不同但長度完全相同的一組讀段，即可判斷它們是否來源于同一個環形DNA。同時該特征可用于幫助精準區分染色體外環形DNA和串聯重復序列(如圖3所示)。

該研究開發的SMOOTH-seq方法能以較高準確度檢測基因點突變（SNV）。

該研究開發的SMOOTH-seq方法可以在結直腸癌腫瘤樣本中準確檢測出各種基因組結構變異事件。在對患者結直腸癌腫瘤樣本的分析中，以在結直腸癌的至少2個單細胞中同時檢測到為標準，該研究檢測出8，594個結構變異事件（4，089個插入事件，3，852個缺失事件，341個易位事件，以及312個重復事件）。通過將結直腸癌腫瘤樣本和K562細胞系有的結構變異去除后，該研究共得到3，570個結直腸癌腫瘤細胞特異性的結構變異事件(1，376 插入事件， 1，661 缺失事件， 230 易位事件以及303 重復事件)。同時，該研究通過設置多個對照基因組（包括相應的腫瘤組織、與腫瘤相鄰的正常組織、GM12878細胞系和另一個體的外周血單核細胞的基因組）對檢測出的結構變異事件進行了PCR驗證。此外，該研究發現結直腸癌腫瘤樣本和K562細胞系有的結構變異在所有被檢測的多個人類基因組DNA樣品中均存在，說明這些結構變異事件實際上是由于當前的人類參考基因組不夠完善，缺失了部分關鍵序列信息引起的。今后三代測序將有助于組裝出更完整精準的人類參考基因組序列（生物谷 bioon）