研究人員建立一高通量基因編輯技術，助力水稻功能基因組學研究

華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室謝卡斌課題組建立了一種陣列式CRISPR文庫用于大規模植物基因編輯的方法。利用此方法，該課題組創建了靶向敲除1072個水稻類受體激酶的基因編輯材料，為快速鑒定抗病、抗逆相關的基因提供了新資源?；诖?，該團隊以“A FLASH pipeline for arrayed CRISPR library construction and the gene function discovery of rice receptor-like kinases”為題在Molecular Plant期刊上在線發表了研究論文。

隨著CRISPR/Cas9基因編輯技術在植物中的日益成熟，利用CRISPR文庫進行高通量的遺傳篩選成為可能。目前有兩種 CRISPR 文庫構建策略：混合型文庫（pooled library）和陣列式文庫（arrayed library）。其中，混合型的CRISPR/Cas9文庫已被多個實驗室用于水稻、玉米、番茄等作物的突變體庫的構建，但目前尚未有陣列式CRISPR文庫在植物中應用的報道。

本研究建立了一種陣列式CRISPR庫的快速構建技術，可同時用于小規模和大規模植物基因編輯材料的創制。作者設計了一種PCR片段長度作為Cas9/gRNA載體標簽的策略（PCR fragment-length markers for gRNAs distinguishing，簡稱FLASH標簽），可以通過常規PCR和凝膠電泳讀取每個載體和轉化植株的gRNA信息（即靶基因信息）。本研究中，課題組設計了12個含不同FLASH標簽的CRISPR/Cas載體，并與96孔板高通量克隆技術結合，建立了快速構建Cas9/gRNA質粒文庫的方法。本研究還設計了將含不同FLASH標簽的12個質粒載體混合后轉化水稻的策略，通過PCR檢測轉化植株所含FLASH標簽的片段大小即可讀取gRNA信息，極大地簡化了基因編輯材料的創制過程。

利用FLASH策略，本研究在一年左右的時間內完成了靶向編輯1072個水稻類受體激酶的構建工作。課題組以12個載體混合轉化水稻的方式，通過89個水稻轉化事件獲得了5039棵T0代水稻植株；通過PCR檢測FLASH標簽的方式讀取了每株植物的gRNA信息，成功獲得了955個RLK基因的編輯水稻。對部分材料的基因型鑒定結果表明，目標基因的編輯效率在90%以上。

本研究對脫靶編輯、無T-DNA整合的基因編輯事件也進行了詳細分析，并對15個基因的材料進行了稻瘟病接種試驗，鑒定到了9個抗稻瘟病相關的基因。*后，課題組討論了該方法的優缺點，并提出了構建全基因組規模的陣列式CRISPR文庫的協作方案。(生物谷Bioon.com）