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Nature：北大毛有東團隊利用 AI 提升時間分辨冷凍電鏡分析精度
蛋白質降解調控是極其重要的基本生物化學過程，在細胞周期、信號轉導、**響應、基因調控、新陳代謝、神經退行、癌癥腫瘤、病毒感染以及蛋白毒性響應等主要細胞分子過程中發揮關鍵調控作用。在真核細胞中，絕大部分胞內蛋白都是通過泛素蛋白酶體途徑（Ubiquitin-proteasome pathway），經過泛素化標記被蛋白酶體全酶降解的。2004年，Aaron Ciechanover、Irwin Rose 和 Avram Hershko 三位科學家被授予了諾貝爾化學獎，以表彰他們對該泛素化通路介導蛋白質降解的歷史性發現。
蛋白酶體全酶，又稱為26S proteasome，是由中間一個圓柱形20S核心顆粒和兩端覆蓋的一個或兩個19S調節顆粒組成。19S包含一個環形異源六聚體馬達——AAA-ATPase，通過多個協同ATP水解模式調控蛋白酶體降解泛素化底物。蛋白酶體功能紊亂與人體多種**相關，如癌癥、神經退行性**和****等。蛋白酶體是美國FDA批準的多種**癌癥的上市小分子**的直接靶標。
在正常細胞中，蛋白酶體的功能受到多個水平的嚴格調控。去泛素化酶USP14是*主要的蛋白酶體調控分子，被認為是一個潛力巨大的**癌癥和神經退行性**的重要靶標，其小分子抑制劑曾進入過美國一期臨床研究，但圍繞USP14功能機制的一系列懸而未決的關鍵問題極大限制了其靶向**分子的開發和臨床應用。USP14通過結合26S而被激活，然后以毫秒的時間尺度剪切底物上的泛素鏈。它是如何被蛋白酶體激活并調控蛋白酶體功能的，一直是全球研究機構和生物制藥領域期待解決的關鍵科學問題。
生命分子機器通過高度復雜的非平衡動力學過程和結構變化來實現其特殊功能，這一過程進而受到各種復雜分子間相互作用的精準調控。如何在原子水平直接觀察天然態超大分子機器的功能態動力學過程，給現有的原子結構動態分析技術提出了**挑戰。
2022年4月27日，北京大學毛有東教授團隊在 Nature 在線發表了題為：USP14-regulated allostery of the human proteasome by time-resolved cryo-EM 的研究論文。
該研究報道了利用自主研發的深度學習高精度四維重建技術，發展并應用時間分辨冷凍電鏡，闡明原子水平人源蛋白酶體動力學調控和構象重編程機制的科學發現。

毛有東教授實驗室長期致力于發展基于冷凍電鏡的動力學重建方法，圍繞蛋白酶體、炎癥小體等具有重大臨床應用前景的靶點系統的結構功能、動力學機制和靶向調控分子設計深入開展前沿交叉研究——

2016年報道了人源蛋白酶體基態的3.6 ?冷凍電鏡結構及其他三個亞納米分辨構象，并**發現一個亞穩態構象的核心顆粒物轉運通道處于開放狀態（PNAS 2016; 113: 12991-12996）。

2017年，利用冷凍電鏡解析高分辨率蛋白酶體19S調控復合體在結合組裝伴侶p28的自由態的三維結構，闡釋了組裝伴侶蛋白Gankyrin/p28在蛋白酶體組裝過程中構象選擇的組裝機理（Molecular Cell 2017; 67: 322-333）。

2018年4月，報道了6個ATPγS結合狀態下的26S蛋白酶體動態結構，包括三個核心顆粒復合物開放態對應的亞穩簡并態近原子分辨（4~5 ?）結構（Nature Communications 2018, 9: 1360）。

2018年11月，**報道了人源蛋白酶體26S在降解底物過程中的七種中間態構象的高分辨（2.8~3.6埃）結構，在原子水平呈現了蛋白酶體和底物相互作用的動態過程，**實現了對AAA-ATPase六聚馬達分子內ATP水解全周循環的完整過程的原子水平觀測（Nature 2019; 565:49-55）。
這一系列工作揭示了蛋白酶體的原子架構、組裝原理和降解泛素化底物的動力學基本規律。
 圖1. (A) USP14調控下蛋白酶體復合體降解多泛素化底物的原子結構模型之一。(B) 時間分辨率冷凍電鏡解析13種中間態的統計分布隨蛋白質降解進程的時間演化。（Youdong Mao, CC BY 4.0）
本研究課題進行之初，首先要克服的問題就是“時間分辨”。蛋白酶體降解底物的過程是很快的，時間尺度在毫秒至秒之間。正常條件下，想要通過冷凍電鏡技術捕獲此過程的中間態結構，是非常困難的。
所以，課題組首先要讓這個過程慢下來。通過大量的條件摸索，重建反應動力學體系和優化反應條件，包括優化緩沖體系、反應溫度等條件，課題組優化出較為可行的實驗方案，從而使得時間分辨冷凍電鏡技術應用成為可能，*終獲得了含時的45,193張USP14-26S復合體降解泛素底物過程中的冷凍電鏡透射圖樣，挑取了3,556,806個USP14-26S-泛素底物復合體的顆粒圖像。
接下來面臨的極端挑戰就是“三維分類”，冷凍電鏡捕獲的復合體圖像需要經過一系列的分類，將它們歸為不同的構象類別，才能呈現出蛋白反應的動態過程。USP14結合到26S蛋白酶體后，使得降解底物的動力學過程更加復雜，想要在如此多的異構復合體顆粒圖像中，鑒別出降解過程的各個時態的高分辨率非平衡構象，傳統的三維分類方法是無法實現的。低精度的三維分類將導致低分辯的三維重建，從而無法獲取原子水平的動力學信息，無法對含時的數據賦予自洽的動態變化的物理意義。
課題組結合經過數年自主開發的新型深度學習高精度三維分類和四維重建方法，捕獲了USP14-26S復合體降解多泛素化底物過程的13種不同功能中間狀態的高分辨率（3.0~3.6埃）非平衡構象，通過時間分辨冷凍電鏡分析，重建了受控蛋白酶體的完整動力學工作周期，并結合分子生物學功能和基因突變研究，闡明了USP14和26S相互調控活性的原子結構基礎和非平衡動力學機制。
研究發現USP14的活化同時依賴于泛素識別和蛋白酶體RPT1亞基的結合。出人意料的是，USP14通過別構效應，誘導蛋白酶體同時沿著兩條并行狀態轉變路徑發生構象變化；課題組成功捕獲到了底物降解中間狀態向底物抑制中間狀態的瞬時轉化。在底物降解途徑中，USP14活化變構地重編程AAA-ATP酶馬達的構象景觀（Conformational landscape）和統計分布，并刺激20S底物通道的打開，從而觀察到底物持續轉運過程的ATPase六聚馬達非對稱ATP水解和近乎完整的全周循環周期。
USP14-ATPase的動態相互作用，使得ATPase馬達底物識別與26S自身的去泛素化酶RPN11催化發生去耦合效應，并在26S的泛素識別、底物的起始易位和泛素鏈回收過程中引入三個調控檢查點（動力學分岔點）。這些發現為USP14調節26S的完整功能周期提供了全新的高分辨見解，并為USP14靶向****發現奠定了極為重要的機制基礎。
圖2. 通過時間分辨冷凍電鏡分析獲取的USP14調控蛋白酶體底物降解的并行路徑模型。（Youdong Mao, CC BY 4.0）
Nature 同期在線發表了題為：Control of human protein-degradation machinery revealed 的Research Briefing專欄推介文章，發表了審稿人和 Nature 編輯團隊的官方點評，其中審稿人評價：該工作是一項重大研究，終于在原子水平解決了USP14活化和其調控蛋白酶體功能的機制問題。Nature 編輯團隊指出：這一工作通過時間分辨冷凍電鏡，結合功能分析，……，呈現了蛋白質降解過程中USP14和蛋白酶體的構象連續體。
 
這是**將人工智能四維重建技術用于提升時間分辨冷凍電鏡分析精度，針對重大**靶蛋白復合體，實現原子水平功能動力學觀測的國際**原創成果，展示了一類新型的蛋白質復合動力學研究范式。
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