Science：施一公團隊解析出非洲爪蟾核孔復合體的細胞質環結構

核孔復合體（nuclear pore complex, NPC）位于核膜（NE）上，介導細胞核-細胞質貨物運輸。作為細胞中*大的分子機器之一，脊椎動物NPC由細胞質絲（cytoplasmic filament）、細胞質環（cytoplasmic ring, CR）、內環（inner ring）、核環（nuclear ring）、核籃（nuclear basket）和管狀環（luminal ring）組成。每個NPC有八個重復的亞基。NPC的結構測定是了解其功能機制的先決條件。在過去的二十年里，綜合建模，即把核孔蛋白（nucleoporin, Nup）和亞復合物的X射線結構與低溫電子斷層掃描重建相結合，在推進人們對NPC的認識方面發揮了關鍵作用。

CR一直是結構研究的一個主要焦點。人類NPC的CR亞基通過低溫電子斷層成像技術進行子斷層掃描圖平均化（subtomogram averaging）而得到重建，其整體分辨率為約20埃，局部分辨率為約15埃。每個CR亞基包括兩個Y型多組分復合體，稱為內側Y復合體和外側Y復合體。八個內側和八個外側的Y復合體以頭到尾的方式組合在一起，分別形成近端和遠端環，構成了CR支架。為了實現更高的CR分辨率，來自中國西湖大學的施一公課題組在一項新的研究中使用單顆粒低溫電鏡（cryo-EM）對來自非洲爪蟾卵母細胞核膜的完整NPC進行成像。對非洲爪蟾CR亞基的核心區域和Nup358區域的重建達到了5～8埃的平均分辨率，從而可以識別二級結構元件。相關研究結果發表在2022年6月10日的Science期刊上，論文標題為“Structure of the cytoplasmic ring of the Xenopus laevis nuclear pore complex”。

以前所有的電鏡圖都不能很好地確定CR亞基各組分之間的堆積相互作用。5～8埃的電鏡圖強烈地提示著了CR亞基存在其他組分，但仍有待確定。解決這些問題需要提高低溫電鏡重建的分辨率。因此，這些作者可能需要改善樣品制備，優化圖像采集，并開發一種有效的數據處理策略。

為了減少樣品的構象異質性，這些作者用*小的力將打開的核膜鋪到網格上，并使用化學交聯劑戊二醛來穩定NPC。為了減輕NPC的方向偏差，他們讓樣品網格發生傾斜，并在較高的角度用較高的電子劑量對樣品進行成像。他們改進了圖像處理流程。通過這些努力，CR亞基的核心區域和Nup358區域的平均分辨率分別提高到3.7埃和4.7埃。此外，Nup358的N末端α-螺旋結構域的低溫電鏡結構達到3.0埃的分辨率。這些電鏡圖允許在每個CR亞基中識別5個Nup358拷貝、2個Nup93拷貝、2個Nup205拷貝和2個Y復合體。依靠這些電鏡圖并在AlphaFold預測的幫助下，他們為非洲爪蟾NPC的CR亞基生成了一個*終模型。他們的CR亞基模型包括30個Nup的19037個氨基酸。

非洲爪蟾NPC雙層CR的低溫電鏡結構。圖片來自Science, 2022, doi:10.1126/science.abl8280。

這些作者發現Nup160的一個以前未知的C末端片段構成了一個頂點（vertex）的關鍵部分，Y復合體的短臂、長臂和莖部在個頂點相遇。Nup160的C末端片段直接與β推進蛋白Seh1和Sec13結合。兩個彼此不接觸的Nup205分子通過不同的界面與內側和內側的Y復合體結合。兩個Nup205分子的構象彈性可能是它們與近端和遠端CR環中不同Nup結合的多樣性的基礎。兩個Nup93分子，每個都包括一個N端延伸螺旋和一個ACE1結構域，連接內側和內側的Y復合體和Nup205。Nup93和Nup205一起在介導相鄰的CR亞基之間的接觸中發揮了關鍵作用。五個Nup358分子，呈蝦尾形狀，被命名為“鉗子（clamp）”，夾住這兩個Y復合體的莖部。這種先天的構象彈性使每個Nup358鉗子能夠適應不同的局部環境，以實現與相鄰Nup的*佳相互作用。在每個CR亞基中，α螺旋狀的Nup似乎提供了構象彈性；12個β推進蛋白可能加強了CR支架的作用。

綜上所述，這些作者構建出的基于電鏡圖的非洲爪蟾CR亞基模型比已報道的脊椎動物CR亞基的復合模型大大擴展了分子質量。除了這兩個Y復合體外，五個Nup358、兩個Nup205和兩個Nup93分子構成了CR的關鍵組分。這些改進后的電鏡圖揭示了對CR中不同Nup之間的界面的新見解。（生物谷 Bioon.com）